上海烜雅生物科技有限公司
伪狂犬病毒通用型（PRV-gH）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）
通用名称：伪狂犬病毒通用型（PRV-gH）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）
Name ：Pseudorabies Virus gH gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】50T/盒
伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)又称猪疱疹病毒Ⅰ型、传染性延髓麻痹病毒、奇痒症病毒、奥叶兹基氏病病毒。是引起牛、羊、猪、犬和猫等多种家畜和野生动物发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的疱疹病毒[1]。猪是伪狂犬病的唯一自然宿主，对其危害大。可致妊娠母猪流产，产死胎及胎儿干尸化。对初生仔猪则引起神经症状，出现运动失调，麻痹，衰竭死亡，病死率 100%。成年猪多呈隐性感染，但可引起呼吸道症状[2]。病猪、带毒猪及带毒鼠类是本病的主要传染源，病毒主要从病猪的鼻分泌物、唾液、乳汁和尿中排除，有的带毒猪可持续排毒一年。
本试剂盒利用实时荧光 PCR 原理，检测伪狂犬病毒，对伪狂犬病毒引起的疾病及其并发症的诊断及疗效评
估有重要指导意义。
本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，设计一对伪狂犬病病毒通用型特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光 PCR 技术对伪狂犬病病毒通用型的 DNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。
包装规格 | 50T/盒 |
PRV-gH 反应液 | 500μL×2 管 |
酶液 | 50μL×1 管 |
PRV-gH 阳性质控品 | 50μL ×1 管 |
阴性质控品 | 250μL ×1 管 |
说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。
ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
病死或扑杀的猪，取脑、淋巴结、脾脏、肺脏等组织；待检活猪，用棉拭子取鼻腔分泌物、唾液、乳汁等， 置于 50%甘油生理盐水中，或用注射器取血 5mL。
上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输， 严禁反复冻融。
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理
组织样品：每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0. 5g 于研磨器中研磨，加入
1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；分泌物棉拭子直接取 100μL 提取；血液取血清 100μL 提取。
推荐采用上海烜雅生物科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按照 试剂说明书进行操作。
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，单个测试反应液体系配制如下表：
试剂 | PRV-gH 反应液 | 酶液 |
用量（样本数为 N） | 20μL | 1μL |
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21μL/管。
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；
荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择
ROX 参比荧光，选择 None 即可。
4.3 推荐循环参数设置：
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5.1 结果分析条件设定
设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。
阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；
可疑：检测通道 35<Ct 值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为 35<Ct 值≤38，且曲线有明显的增长曲线， 判定为阳性，否则为阴性；
阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。
阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32；以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3. 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
1. 所有操作严格按照说明书进行；
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3. 反应液应避光保存；
4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
[1] 娄高明，杜伟贤．伪狂犬病流行概况及猪场防制策略[J]．中国动物检疫，1999，16（5）：43－45.
[2] 殷震，刘景华．动物病毒学[M]．北京：科学出版社，1997.
[3] 国家质量监督检验检疫总局.GB/T 35911-2018 伪狂犬病病毒荧光 PCR 检测方法.[S].
企业名称：上海烜雅生物科技有限公司
